l
l نمط الفصل الكهربائي للكولاجين بعد التمليح.
يعني الاستخراج الأنزيمي أنه بعد استخلاص الكولاجين القابل للذوبان والكولاجين القابل للذوبان في الأحماض ، يلزم تحلل بعض البروتياز ، مثل كولاجيناز ، وبيبسين ، وغراء ، وكيموتريبسين ، للحصول على كولاجين مختلف قابل للذوبان في الإنزيم. تنقسم البروتياز المستخدمة بشكل أساسي إلى 3 أنواع: البروتياز الحيواني (مثل التربسين والبيبسين) والبروتياز النباتي (مثل البابين والبروميلين) والبروتياز الميكروبي (مثل البروتياز القلوي والبروتياز المحايد). في البحث عن التحلل الأنزيمي للكولاجين ، يعتبر البروتياز القلوي هو الأكثر استخدامًا.
يتحلل الكولاجين بطريقة مقيدة ، أي يتم شق الببتيد النهائي. نظرًا لأن الروابط التساهمية بين سلاسل ببتيد الكولاجين تتشكل عن طريق تفاعل ليسين أو هيدروكسيليسين في الببتيد الطرفي الجزيئي ، يتم شق الببتيد الطرفي. يمكن إذابة الجزء الرئيسي الذي يحتوي على هيكل اللولب الثلاثي في الأحماض العضوية المخففة واستخلاصه. يمكن أن يؤدي العلاج بالإنزيم إلى تحلل الببتيد الطرفي لفيبرين الكولاجين ، وتحسين إنتاج الكولاجين ؛ ولن تدمر البنية الحلزونية الثلاثية للكولاجين وتحافظ على خصائصها. هناك العديد من العوامل التي تؤثر على استخلاص الإنزيم ، مثل تركيز الإنزيم ، ونسبة الإنزيم إلى الركيزة ، ووقت التحلل المائي الإنزيمي ، ودرجة حرارة التحلل المائي الإنزيمي ، وقيمة الأس الهيدروجيني ، ونسبة المادة إلى السائل. في العملية الفعلية ، يتم استخلاص معظم الكولاجين بطريقة مركب الإنزيم ، ويتم استخلاص المزيد عن طريق البيبسين ، والحمض العضوي هو في الغالب حمض الأسيتيك.
l مخطط كهربية الكولاجين المستخرج من البيبسين
تنقسم عملية التحلل المائي الأنزيمي للكولاجين بشكل أساسي إلى طريقة التحلل المائي أحادي الإنزيم وطريقة التحلل المائي متعدد الإنزيمات. تنقسم طريقة التحلل المائي متعدد الإنزيمات أيضًا إلى طريقة التحلل المائي الأنزيمي المختلط (مثل التربسين البقري ، والبروناز ، والبروتياز المخلوط) وطريقة التحلل الأنزيمي خطوة بخطوة. يجب عادةً تطوير اختيار عملية تجريبية محددة وشروط الاستخراج الأنزيمي لكولاجين الجلد. للحصول على بولي ببتيدات الكولاجين بأوزان جزيئية أصغر ، يتم استخدام التحلل المائي متعدد الإنزيمات بشكل عام. العوامل الرئيسية التي تؤثر على تأثير الإنزيم هي نوع الإنزيم وكمية الإنزيم المضافة ودرجة حرارة التحلل الإنزيمي ووقت التحلل الإنزيمي وقيمة الأس الهيدروجيني ونسبة المادة إلى الماء. لا يمكن أن يؤدي استخدام الاستخراج الأنزيمي للكولاجين بشكل إجمالي إلى تقصير وقت الاستخراج بشكل فعال فحسب ، بل أيضًا الحصول على الكولاجين بنشاط بيولوجي جيد ، كما أن تلوث البيئة ضئيل أيضًا. لا يتم تحلل الكولاجين بسهولة عن طريق البروتياز الشائع ، ولكن يمكن تكسيره بواسطة كولاجيناز الحيوان ، ويمكن تحلل الأجزاء المكسورة بواسطة الأنزيم البروتيني الشائع بعد التمسخ التلقائي. الظروف المناسبة للبيبسين لتحلل الكولاجين هي درجة الحموضة 1. 65-1 .70 ودرجة الحرارة 37 درجة.
يستخدم بعض الأشخاص عظام الخنازير كمواد خام ويستخدمون تفاعل التحلل المائي الأنزيمي للبروتياز لاستبدال عملية صنع الغراء التقليدية وإجراء بحث تجريبي حول تفاعل التحلل المائي الأنزيمي للكولاجين وعملية صنع الغراء الإنزيمي. أظهرت النتائج أن البيبسين يحتوي على أعلى معدل استخراج للكولاجين (46.14 بالمائة) ، يليه التربسين (43.42 بالمائة) ، البروتياز المحايد (3 0. 14 بالمائة) ، والبروتياز القلوي (21.15 بالمائة). تم تحسين العوامل المؤثرة الرئيسية في تفاعل التحلل المائي الإنزيمي للبيبسين بواسطة عامل واحد وتجارب متعامدة. أظهرت نتائج الاختبار أن الظروف المثلى لاستخراج البيبسين هي أن تركيز البيبسين هو 1 في المائة ، ويتم إجراء التحلل المائي الأنزيمي عند درجة الحموضة 2.0 لمدة 48 ساعة ، ثم يتم تمليحها في محلول كلوريد الصوديوم بتركيز 10 في المائة (وزن / حجم). ) لمدة 24 ساعة. كان معدل الاسترداد النهائي للكولاجين 64.77٪ ، ومعدل استخلاص الكولاجين 49.75٪. استخدم بعض الأشخاص أيضًا البيبسين لاستخراج كولاجين جلد الخنزير ، وتحلل أربع جرعات مختلفة من البيبسين (1 في المائة ، 2 في المائة ، 2.5 في المائة ، 3 في المائة) لأخذ العينات والاختبار ، تم استخدام معادلة هيل من الدرجة الأولى لمحاكاة عملية استخلاص البيبسين. تم الحصول على كولاجين جلد الخنزير وعملية الاضمحلال لمعدل التحلل المائي للبيبسين ، وأخيراً تم الحصول على معدل الاستخلاص بنسبة 2 بالمائة من جرعة البيبسين و 6-7 ساعة من زمن التحلل المائي. أقصى. بعض الناس يستخدمون جلد الخنزير الطازج كمادة خام ، يتحلل بالماء مع التربسين بشرط 50-52 درجة ، جرعة الإنزيم هي 5000: 1 ~ 10000: 1 ، قيمة الرقم الهيدروجيني 9 ، التفاعل هو 2-3 ح ، المادة الخام: الماء عبارة عن تحلل إنزيمي تحت ظروف 1: 2. أظهرت النتائج أن معدل استخلاص البروتين الكلي كان أكبر من أو يساوي 80٪.
l معدل استعادة الكولاجين في جلد الحبار بواسطة البيبسين تحت درجة حرارة متغيرة.
عند استخدام الطريقة الأنزيمية لاستخراج الكولاجين ، يجب مراقبة شروط الاستخلاص بصرامة:
أولاً ، يجب أن يكون وقت عمل الإنزيم مناسبًا. إذا كان الوقت قصيرًا جدًا ، فلن يتم إطلاق الكولاجين بالكامل في المستخلص ، مما سيؤثر على معدل الاستخراج ؛ إذا كان وقت عمل الإنزيم طويلًا جدًا ، فسيتم تحلل الكولاجين بشكل مفرط ، مما ينتج عنه الكثير من الببتيد الصغير المر للغاية ، والذي لن يؤدي فقط إلى زيادة كفاءة الفصل والتنقية ، كما تؤثر الصعوبة أيضًا على الخصائص الوظيفية والنشاط البيولوجي للكولاجين.
ثانيًا ، يجب أن تكون درجة حرارة التحلل المائي الأنزيمي مناسبة. إذا كانت درجة الحرارة منخفضة جدًا ، فإن تأثير الإنزيم ليس واضحًا ؛ إذا كانت درجة الحرارة مرتفعة للغاية ، فسوف يتسبب ذلك في تعطيل الإنزيم وتمسخ الكولاجين. وفقًا للتقارير ، عندما يكون الأس الهيدروجيني للوسط أقل قليلاً من متعادل ، تكون درجة حرارة تمسخ الكولاجين 40-41 درجة ، عندما يكون الرقم الهيدروجيني للوسط حمضيًا ، تكون درجة حرارة تمسخ الكولاجين 38-39 درجة ، ودرجة حرارة تمسخ كولاجين جلد السمك هي 7-12 درجة أقل من درجة حرارة تمسخ كولاجين جلد الخنزير. لذلك ، إذا كان للكولاجين المستخرج أن يكون له نشاط بيولوجي جيد ، فيجب أن تكون درجة حرارة الاستخلاص أقل من درجة حرارة التمسخ أثناء عملية الاستخراج.
ثالثًا ، يجب اختيار الإنزيم المناسب. بشكل عام ، عند استخلاص الكولاجين من أنسجة الثدييات الأرضية ، فمن المعقول استخدام البيبسين لاستخلاصه في درجة الحرارة المثلى ، ولكن بالنسبة للحيوانات المائية مثل الأسماك ، تكون درجة حرارة تمسخ الكولاجين أقل من درجة حرارة الثدييات الأرضية. لذلك ، فإن العديد من البروتياز غير مناسب ، وقد يتم تدمير بعض الخصائص الوظيفية والأنشطة البيولوجية للكولاجين إذا تم استخلاصه في درجة الحرارة المثلى لهذه الإنزيمات. إن البحث عن استخلاص الكولاجين وعديد الببتيدات بالطرق الأنزيمية هو أساسًا من جلود الحيوانات ومشتقاتها ، وهناك القليل من التقارير حول استخدام الطرق الأنزيمية لاستخراج الكولاجين وعديد الببتيدات من عظام الحيوانات.
